Innowacyjny system dostarczania mesalazyny w leczeniu chorób zapalnych jelit

Jakie wyzwania stawia przed nami dostarczanie leku?

Dostarczanie substancji czynnej do odpowiedniej części przewodu pokarmowego (GIT) w sposób przewidywalny i przedłużony, przy jednoczesnym minimalizowaniu miejscowych i ogólnoustrojowych działań niepożądanych, stanowi od lat istotne wyzwanie dla technologii farmaceutycznej i medycyny. Wiele leków podawanych doustnie wymaga ochrony przed kwaśnym środowiskiem żołądka lub jest słabo tolerowanych przez pacjentów, powodując działania niepożądane w przewodzie pokarmowym, co może obniżać przestrzeganie zaleceń terapeutycznych i skuteczność leczenia.

Naukowcy z sukcesem opracowali nowy system dostarczania leków oparty na kuleczkach żelowych (beads) z gumy gellanowej, przeznaczony do celowanego uwalniania 5-aminosalicylowego kwasu (5-ASA, mesalazyna) w jelicie grubym. Mesalazyna, stosowana w leczeniu nieswoistych chorób zapalnych jelit (IBD), takich jak wrzodziejące zapalenie jelita grubego czy choroba Leśniowskiego-Crohna, po standardowym podaniu doustnym jest szybko wchłaniana w proksymalnej części przewodu pokarmowego, co ogranicza jej działanie miejscowe i może prowadzić do występowania działań niepożądanych. Wiele dostępnych na rynku preparatów o zmodyfikowanym uwalnianiu (MR) ma niewystarczającą skuteczność, uwalniając część substancji czynnej przed dotarciem do dystalnej części przewodu pokarmowego.

Jak produkt jest wytwarzany i jakie ma właściwości?

W badaniu zastosowano innowacyjne podejście łączące dwie metody stabilizacji matryc polimerowych: żelifikację jonotropową (IG) z użyciem jonów wapnia oraz sieciowanie chemiczne z wykorzystaniem glutaraldehydu (GA). Guma gellanowa została wybrana jako główny polimer ze względu na zdolność do szybkiej transformacji zol-żel w wyniku żelifikacji jonotropowej, co pozwala na tworzenie matryc zawierających lek, zarówno w celu zmiany miejsca uwalniania leku, jak i zapewnienia ochrony substancji czynnej przed kwaśnym środowiskiem żołądka. Dodatkowo testowano formulacje zawierające inne naturalne polimery, takie jak κ-karrageenan i hydroksyetyloceluloza (HEC).

Proces przygotowania kulek obejmował rozproszenie polimerów w wodzie dejonizowanej, podgrzanie mieszaniny do 80±2°C przy ciągłym mieszaniu, a następnie obniżenie temperatury do 70±2°C i dodanie surfaktantu oraz 5-ASA. Homogeniczną zawiesinę pompowano przez igłę i dodawano kroplami do roztworu zawierającego jony wapnia (1% CaCl₂). Po 15 minutach (czas utwardzania) kulki zbierano przez dekantację i przemywano trzykrotnie wodą destylowaną. Formulacje wymagające dodatkowej metody sieciowania natychmiast dodawano do roztworu zawierającego GA (1%) w temperaturze 50±2°C na 2 godziny przy ciągłym mieszaniu. Następnie kulki były suszone metodą cieplną (45±2°C przez 48 godzin) lub liofilizowane.

Badania morfologiczne z wykorzystaniem skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) wykazały, że otrzymane kuleczki miały nieregularną, pomarszczoną powierzchnię, najprawdopodobniej pokrytą kryształami 5-ASA. Kryształy wydawały się występować nie tylko na powierzchni kulek, ale również zanurzone w matrycach. Na powierzchni, oprócz kryształów API, widoczne były również podłużne włókna polimerowe. Nie zaobserwowano znaczących różnic między formulacjami składającymi się z różnych polimerów – wszystkie tworzyły trójwymiarowe struktury zawierające API.

Bezpośrednio po wytworzeniu przygotowane kulki poddano obserwacjom wizualnym. Morfologia (struktura, kształt, rozmiar i twardość) zależy od szeregu czynników, takich jak temperatura początkowej zawiesiny, stężenia czynników sieciujących i polimeru, prędkość mieszania, wysokość i prędkość wkraplania czy technika suszenia. Uzyskane kulki wykazywały różne kształty – większość była okrągła i sferyczna, ale zaobserwowano również kulki w kształcie kropli lub przecinka przed suszeniem. Różowy odcień kulek pochodzi od API, ponieważ roztwór polimeru jest bezbarwny, a po wysuszeniu kolor kulek jest mniej intensywny. Po suszeniu cieplnym kulki były twarde i znacznie zmniejszyły średnicę. Widoczne było również pewne spłaszczenie na dolnej stronie kulek, co jest bardzo częstym zjawiskiem po suszeniu cieplnym w wyniku parowania wody, powodującego utratę elastyczności kulek. Po liofilizacji zmniejszenie rozmiaru było znacznie mniejsze, ale kulki były znacznie bardziej miękkie i piankowe, o niskiej gęstości.

Czy biofizyczne i toksycznościowe badania potwierdzają skuteczność formulacji?

Kluczowym aspektem badania było określenie wpływu sieciowania glutaraldehydem na właściwości pęcznienia i uwalniania leku. Testy pęcznienia w różnych warunkach pH (1,2; 4,5 i 7,4) odpowiadających fizjologicznym warunkom występującym podczas przechodzenia matryc przez przewód pokarmowy wykazały, że wszystkie kuleczki po wysuszeniu zachowały zdolność do absorpcji wody. Najmniejsze zmiany masy kulek zaobserwowano przy pH = 1,2, przy czym najwyraźniejszy wzrost masy wystąpił w pierwszej godzinie eksperymentu. Podobny efekt, ale z większą szybkością, zaobserwowano przy pH = 7,4 – po znaczącym wzroście w pierwszej godzinie masa kulek była mniej więcej stabilna. Formulacje przygotowane metodą IG i GA wydawały się pęcznieć mniej w porównaniu z innymi, co sugeruje, że sieciowanie glutaraldehydem znacząco poprawia stabilność mechaniczną matryc.

Badania in vitro uwalniania leku wykazały, że formulacje F19, F20 i F21 (przygotowane metodą IG i GA) uwalniały około 10-12% zawartego 5-ASA w środowisku kwaśnym w ciągu 2 godzin, podczas gdy formulacje F13-F15 (przygotowane tylko metodą IG) uwalniały około 20% API w tym samym czasie. Wszystkie pozostałe formulacje (głównie liofilizowane) uwalniały ponad 30% API. Przy pH = 7,4 wszystkie formulacje uwalniały lek znacznie intensywniej w porównaniu do pH = 1,2. Formulacje F19-F21 (IG, GA, HD) wydawały się uwalniać 5-ASA w najbardziej przedłużony sposób, uwalniając 50-70% API w ciągu 6 godzin. W pierwszych 2 godzinach analizy, formulacje F19-F21 uwalniały tylko około 20% początkowej zawartości leku, co sugeruje znaczący potencjał w przenoszeniu pozostałej ilości API do dystalnych części.

Warto podkreślić, że opracowane formułacje osiągnęły wysoką efektywność enkapsulacji 5-ASA, średnio na poziomie 93,95% (w zakresie od 86,95% do 98,45%), przy zawartości substancji czynnej stanowiącej od 43,47% do 49,76% masy kulek. Dobrze przygotowany i zoptymalizowany proces wytwarzania takich formulacji zaowocował wysoką wydajnością, co jest szeroko potwierdzane w literaturze.

Badania cytotoksyczności przeprowadzono na linii komórkowej gruczolakoraka jelita grubego Caco-2 oraz na nierakowej linii komórek nabłonkowych gruczołu sutkowego MCF-12A. W tym eksperymencie tylko związek F13 w najwyższym stężeniu ekstraktu (100%) zmniejszył żywotność komórek Caco-2 (do 25%), natomiast pozostałe badane związki nie wykazały znaczącej cytotoksyczności wobec linii komórkowej raka okrężnicy Caco-2 i nierakowych komórek MCF-12A. Zgodnie z normą ISO10993, cytotoksyczność związku jest uznawana za znaczącą tylko wtedy, gdy przeżywalność komórek jest niższa niż 70% w porównaniu z próbą kontrolną.

Interesującym aspektem badania była ocena toksyczności przygotowanych formulacji za pomocą testu ostrej toksyczności Microtox, który opiera się na zmniejszeniu bioluminescencji bakterii Aliivibrio fischeri po kontakcie z badaną próbką. Zaobserwowano ciekawe zjawisko dla próbek, w których glutaraldehyd został użyty jako czynnik sieciujący – toksyczność tych formulacji była znacznie wyższa niż innych, a toksyczność znacznie wzrosła po 15 minutach testu w porównaniu do odczytu po 5 minutach. Przypisano to uwalnianiu glutaraldehydu z materiałów, który wykazuje działanie przeciwbakteryjne mogące wpływać na wyniki testu Microtox. Co istotne, mierzone zmniejszenie bioluminescencji w porównaniu między pustymi i załadowanymi formulacjami sugeruje, że 5-ASA zmniejsza toksyczny efekt wszystkich badanych systemów dostarczania leków, w tym zawierających glutaraldehyd.

Przeprowadzone badania wykazały również, że metoda suszenia miała istotny wpływ na właściwości końcowe kulek. Wszystkie liofilizowane kulki absorbowały wodę w znacznie większym stopniu w porównaniu z ich odpowiednikami suszonymi cieplnie. Generalnie, formulacje przygotowane metodą IG i GA pęczniały mniej w porównaniu z innymi. Można również stwierdzić, że obecność κ-karagenianu w formulacji zmniejszała szybkość pęcznienia we wszystkich warunkach (np. F15, F21). Taki efekt karagenianu był wcześniej opisywany w literaturze.

Czy in vivo badania potwierdzają przedłużoną efektywność formulacji?

Badania in vivo dostępności leku przeprowadzono na szczurach Wistar, którym podawano doustnie zawiesinę 5-ASA, formulację przygotowaną tylko metodą IG lub formulację wykorzystującą zarówno IG, jak i GA. Stężenie leku w osoczu monitorowano przez 24 godziny. Wyniki wykazały, że stężenie 5-ASA w osoczu w przypadku zawiesiny czystego leku osiągnęło najwyższy poziom (17 ng/ml) około 2 godzin po podaniu, po czym lek został szybko wyeliminowany z krwi, osiągając 0 ng/ml po 12 godzinach. Przygotowane formulacje spowodowały przedłużone i stałe uwalnianie 5-ASA. Stężenie w osoczu zaczęło wzrastać po 2 godzinach, osiągając maksymalny poziom 8 ng/ml i 6 ng/ml odpowiednio dla formulacji IG i IG+GA po 6 godzinach. Spadek stężenia był następnie obserwowany szybciej w formulacji F15 niż w F21. Po 24 godzinach od podania stężenie 5-ASA w osoczu wynosiło nadal około 4 ng/ml dla formulacji F21. Sugeruje to, że sieciowanie za pomocą GA znacząco zmienia zachowanie podawanego leku w organizmie.

Warto zwrócić uwagę na potencjalne zastosowanie kliniczne opracowanych formulacji. Mesalazyna jest powszechnie stosowana w leczeniu chorób zapalnych jelit, jednak jej skuteczność jest często ograniczona ze względu na przedwczesne wchłanianie w górnych odcinkach przewodu pokarmowego. Opracowane kulki gellanowe z dodatkiem glutaraldehydu wykazują potencjał do znacznego ograniczenia uwalniania leku w żołądku (pH 1,2) i przedłużonego uwalniania w środowisku jelita (pH 7,4), co może przełożyć się na lepszą skuteczność terapeutyczną i zmniejszenie działań niepożądanych.

Jakie wyzwania i perspektywy wiążą się z zastosowaniem opracowanych systemów?

Autorzy badania zwracają uwagę na potencjalne ograniczenia związane z ekstrapolacją wyników z modelu szczurzego na ludzi, szczególnie w kontekście różnic w mikrobiocie jelitowej. Mikrobiota jelitowa może wpływać na biodostępność leków poprzez enzymatyczną transformację struktury leku. Jak przedstawili Weesrma i wsp., szczury leczone antybiotykami mają wyższe poziomy koniugatów glutationu acetaminofenu we krwi niż nieleczone szczury. W końcowej aktywności należy ocenić również inne leki przyjmowane przez pacjentów. Leki takie jak inhibitory pompy protonowej (PPI) i metformina mogą zmieniać skład i funkcję mikrobiomu jelitowego. Zmiany te mogą zmniejszyć skuteczność leku.

Interesującą metodą oceny dystrybucji formulacji w przewodzie pokarmowym jest obrazowanie MRI. Jak opisali Vieira i wsp., GG ma odpowiednią właściwość do wizualizacji za pomocą tej metody. Poza umożliwieniem sieciowania hydrożelu in situ, jonowa interakcja między GG a jonami metali może być również wykorzystana do włączenia Mn²⁺ do matrycy hydrożelowej w celu śledzenia za pomocą MRI. Badania wykazały, że Mn²⁺ wiąże się silnie z GG, szczególnie w grupach karboksylowych jednostek D-glukuronianu. Ich badania wykazały, że degradowalne mieszanki hydrożeli składające się z metakrylowanego GG (GG-MA) i kwasu hialuronowego mogą być łączone z Mn²⁺, aby ułatwić dostarczanie komórek do przestrzeni podpajęczynówkowej pod kontrolą obrazowania. Ta cecha może być wykorzystana do obserwacji kulek załadowanych 5-ASA rozmieszczonych w przewodzie pokarmowym szczurów po podaniu doustnym i określenia, czy formulacja dotarła do dystalnych części przewodu pokarmowego.

Warto również wspomnieć, że w literaturze opisano pelety zawierające 5-ASA, które mają duży potencjał do przewyższania leków dostępnych na rynku zawierających ten środek przeciwzapalny. Sardou i wsp. przedstawili warstwowe i matrycowe pelety, które wykazują doskonałą aktywność przeciwko wrzodziejącemu zapaleniu jelita grubego (UC) na modelu szczurzym w badaniach przedklinicznych i z powodzeniem dostarczają API do okrężnicy. Z drugiej strony, Rudolph i wsp. uzyskali zadowalający profil uwalniania, wskazany jako bardziej odpowiedni dla profilu pH ludzkiego jelita krętego niż leki dostępne na rynku zawierające 5-ASA.

Uzyskane wyniki sugerują, że matryce oparte na gumie gellanowej i jej mieszankach z innymi polimerami, wytwarzane przy użyciu metod żelifikacji jonotropowej i sieciowania chemicznego, mogą być odpowiednią postacią leku do dostarczania mesalazyny do dystalnych części przewodu pokarmowego. Co więcej, GA znacząco wpływa na właściwości kulek, powodując zmiany w zachowaniu pęcznienia i szybkości uwalniania zarówno in vitro, jak i in vivo, nie zwiększając jednocześnie toksyczności. Czyni to odpowiednim kandydatem do dostarczania API do okrężnicy w potencjalnym leczeniu zapalnych chorób jelit.

Przedstawione badanie stanowi istotny krok w kierunku opracowania skuteczniejszych systemów dostarczania leków dla pacjentów z chorobami zapalnymi jelit. Opracowane formulacje na bazie gumy gellanowej z dodatkiem glutaraldehydu wykazują potencjał do znacznego ograniczenia uwalniania leku w żołądku i przedłużonego uwalniania w środowisku jelita, co może przełożyć się na lepszą skuteczność terapeutyczną i zmniejszenie działań niepożądanych. Dalsze badania kliniczne są niezbędne do potwierdzenia skuteczności i bezpieczeństwa opracowanych formulacji u ludzi.

Podsumowanie

Opracowano innowacyjny system dostarczania mesalazyny oparty na kuleczkach żelowych z gumy gellanowej, wykorzystujący połączenie żelifikacji jonotropowej i sieciowania chemicznego glutaraldehydem. System ten wykazuje wysoką efektywność enkapsulacji leku (średnio 93,95%) i zapewnia przedłużone uwalnianie substancji czynnej w jelicie grubym. Badania in vitro i in vivo potwierdziły, że formulacje z dodatkiem glutaraldehydu skutecznie ograniczają uwalnianie leku w żołądku (10-12% w ciągu 2 godzin) i zapewniają przedłużone uwalnianie w środowisku jelita. Testy cytotoksyczności wykazały bezpieczeństwo opracowanych formulacji, a badania na szczurach potwierdziły utrzymywanie się stężenia leku w osoczu przez 24 godziny. System ten może znacząco poprawić skuteczność terapii nieswoistych chorób zapalnych jelit poprzez lepsze dostarczanie leku do miejsca docelowego.