Mesalazyna i fosfatazy DUSP: nowy mechanizm w chemioprewencji CRC

Czy mesalazyna może hamować rozwój raka jelita grubego?

Mesalazyna, powszechnie stosowana w leczeniu nieswoistych zapaleń jelit, od lat intryguje onkologów swoimi właściwościami wykraczającymi poza działanie przeciwzapalne. Nowe badanie przeprowadzone na liniach komórkowych jelita grubego ujawnia molekularny mechanizm, który może tłumaczyć obserwowane efekty przeciwproliferacyjne tego leku. Kluczem okazuje się modulacja fosfataz DUSP – enzymów regulujących szlak MAPK, którego nadmierna aktywność napędza rozwój raka jelita grubego.

Rak jelita grubego (CRC) pozostaje trzecim co do częstości nowotworem złośliwym i drugą przyczyną zgonów onkologicznych na świecie. Jego patogeneza wiąże się z zaburzeniami mikrobioty jelitowej wywołanymi dietą zachodnią, przewlekłym stresem i nadużywaniem antybiotyków, które prowadzą do przewlekłego zapalenia i niestabilności genomowej. Mimo postępów w diagnostyce i terapii mechanizmy molekularne progresji guza i oporności na leczenie pozostają niepełne.

W centrum uwagi znajduje się szlak MAPK/ERK, który kontroluje proliferację, różnicowanie i przeżycie komórek. Jego aktywność jest ściśle regulowana przez fosfatazy o podwójnej swoistości (DUSP), które działają jako kluczowe regulatory ujemne. Zaburzenia ekspresji DUSP wiążą się z rozwojem CRC, inwazyjnością i opornością terapeutyczną, jednak ich dokładna rola w odpowiedzi na leczenie pozostaje niejasna.

Jakie fosfatazy DUSP są celami działania mesalazyny?

Badacze postawili hipotezę, że działanie przeciwproliferacyjne mesalazyny jest przynajmniej częściowo mediowane przez przywrócenie regulacji szlaku MAPK zależnej od DUSP. Analizę przeprowadzono na dwóch komplementarnych modelach komórkowych: prawidłowych komórkach nabłonka okrężnicy (CCD-841CoN) i komórkach gruczolakoraka jelita grubego (DLD-1), reprezentujących odpowiednio stan nienowotworowy i nowotworowy nabłonka jelitowego.

Komórki traktowano mesalazyną w stężeniu 15 mM przez 24 godziny – stężenie to odpowiada lokalnym poziomom tkankowym mierzonym w świetle i błonie śluzowej jelita grubego u pacjentów otrzymujących dawki terapeutyczne 2–4 g/dobę. Analizę ekspresji genów przeprowadzono z użyciem mikromacierzy oligonukleotydowych GeneChip™ Human Genome U133A 2.0, a wybrane geny zwalidowano metodą RT-qPCR.

Spośród wszystkich sond związanych z MAPK i DUSP reprezentowanych na mikromacierzy najbardziej wyraźne i statystycznie istotne zmiany ekspresji zaobserwowano konsekwentnie dla członków rodziny DUSP, co wskazuje, że mesalazyna oddziałuje na sygnalizację MAPK głównie na poziomie jej regulatorów ujemnych. Szczególnie wyróżniły się trzy fosfatazy: DUSP1, DUSP4 i DUSP5, które wykazały najwyższe zmiany krotności ekspresji (FC > 3) i stały się przedmiotem dalszych analiz.

Jak mesalazyna zmienia ekspresję genów DUSP w komórkach nowotworowych i prawidłowych?

Globalna analiza ekspresji mRNA ujawniła 24 transkrypty o zmienionej ekspresji między komórkami kontrolnymi a leczonymi mesalazyną. Przy progu FC > 3,0 zidentyfikowano 3 geny, wszystkie istotne statystycznie (p < 0,05–0,001). Hierarchiczna analiza skupień wszystkich wykrytych sond potwierdziła, że leczenie mesalazyną indukuje wyraźne i powtarzalne zmiany w profilu transkrypcyjnym komórek DLD-1, co wskazuje na silną i biologicznie znaczącą odpowiedź komórkową.

Wśród genów różnicowo regulowanych w odpowiedzi na mesalazynę zaobserwowano wyraźną indukcję kilku członków rodziny DUSP. Szczególnie wyróżniły się DUSP1, DUSP4, DUSP5 i DUSP6, jednak tylko DUSP1, DUSP4 i DUSP5 wykazały wysokie zmiany krotności (FC > 3), co stanowiło podstawę do skupienia dalszych analiz na tych fosfatazach jako głównych celach modulacji transkrypcyjnej przez mesalazynę.

Walidacja RT-qPCR ujawniła jednak istotne różnice między typami komórek. W przypadku DUSP1 nie zaobserwowano statystycznie istotnych zmian ekspresji ani w prawidłowych kolonocytach (CCD-841CoN), ani w nowotworowych komórkach DLD-1. Natomiast DUSP4 wykazała wyraźny efekt zależny od linii komórkowej: w komórkach CCD-841CoN mesalazyna spowodowała znaczące obniżenie ekspresji DUSP4 (p < 0,01), podczas gdy w komórkach DLD-1 wyraźnie zwiększyła poziomy transkryptu (p < 0,001).

Najbardziej interesujące wyniki uzyskano dla DUSP5. W prawidłowych komórkach CCD-841CoN leczenie mesalazyną spowodowało wyraźne obniżenie poziomów mRNA DUSP5 (p < 0,001). W przeciwieństwie do tego ekspozycja nowotworowych komórek DLD-1 na mesalazynę wywołała silną indukcję DUSP5, z poziomami transkryptu znacząco podwyższonymi w stosunku do kontroli nieleczonej (p < 0,001). Te odkrycia wskazują na przeciwstawny, zależny od typu komórki efekt regulacyjny mesalazyny na ekspresję DUSP5 – tłumienie transkrypcji w prawidłowych kolonocytach przy jednoczesnej indukcji w komórkach raka jelita grubego.

Co ujawniają dane z tkanek pacjentów z rakiem jelita grubego?

Aby zbadać potencjalną regulację epigenetyczną i transkrypcyjną członków rodziny DUSP w gruczolakoraku jelita grubego (COAD), przeprowadzono analizy in silico z użyciem danych z platformy GEPIA3 i profili metylacji pochodzących z The Cancer Genome Atlas (TCGA). Porównanie profili ekspresji genów ujawniło istotne różnice między tkanką prawidłową a nowotworową jelita grubego.

Dla DUSP1 i DUSP5 zaobserwowano statystycznie istotny spadek ekspresji w raku jelita grubego w porównaniu z tkanką prawidłową (p < 0,001). Co ciekawe, odmienny wzorzec odnotowano dla DUSP4, którego ekspresja była znacząco podwyższona w próbkach guza (p < 0,001). Te obserwacje sugerują, że różne fosfatazy DUSP podlegają odmiennej regulacji w procesie kancerogenezy jelita grubego.

Analiza sieci interakcji białko-białko przeprowadzona w bazie STRING ujawniła, że białka kodowane przez DUSP1, DUSP4 i DUSP5 tworzą wysoce połączoną sieć składającą się z 23 węzłów i 77 krawędzi (p < 0,001; średni wynik ufności = 0,569). Funkcjonalna analiza wzbogacenia genów związanych z DUSP regulowanych przez mesalazynę w raku jelita grubego dodatkowo wykazała, że większość tych genów uczestniczy w szlakach sygnalizacyjnych mediowanych przez kinazy MAPK i ERK1/2.

Spójność między wynikami in vitro a danymi in silico pochodzącymi od pacjentów wspiera potencjalne znaczenie translacyjne regulacji DUSP5 przez mesalazynę. Najbardziej wyraźne i konsekwentne zmiany zaobserwowano dla genu DUSP5 w obu modelach – in vitro i in silico – co stanowiło podstawę do wyboru DUSP5 do dalszych analiz na poziomie białkowym jako obiecującego kandydata do badań nad molekularnymi efektami mesalazyny w raku jelita grubego.

Czy zmiany transkrypcyjne przekładają się na poziom białka?

Analiza stężenia białka DUSP5 ujawniła znacząco wyższe poziomy w grupie leczonej mesalazyną (MES) w porównaniu z grupą kontrolną. Średnie stężenie DUSP5 osiągnęło 7,76 ± 1,45 ng/mL w grupie MES versus 5,70 ± 1,12 ng/mL w kontroli. Wartości mediany wynosiły odpowiednio 7,73 ng/mL i 4,95 ng/mL. Ocena statystyczna testem Manna-Whitneya potwierdziła, że różnica ta była wysoce istotna (p < 0,001).

W ujęciu względnym poziomy białka DUSP5 były 1,56-krotnie wyższe w grupie MES w porównaniu z kontrolą (FC = 1,56↑, p < 0,001). Co więcej, zaobserwowano statystycznie istotną pozytywną korelację między ekspresją mRNA DUSP5 a stężeniem białka DUSP5 w komórkach DLD-1 leczonych mesalazyną (współczynnik Spearmana r = 0,679, p < 0,05).

To odkrycie potwierdza, że indukowana przez mesalazynę zwiększona ekspresja transkrypcyjna DUSP5 znajduje odzwierciedlenie na poziomie białkowym, co dodatkowo wspiera funkcjonalne znaczenie DUSP5 jako kluczowego mediatora molekularnego działania mesalazyny. Spójność zmian na poziomie mRNA i białka wzmacnia wiarygodność biologiczną obserwowanych efektów i sugeruje, że mechanizm działania mesalazyny obejmuje zarówno regulację transkrypcyjną, jak i translacyjną.

Czy mesalazyna wywołuje śmierć komórek nowotworowych?

Aby funkcjonalnie zwalidować molekularne efekty leczenia mesalazyną, oceniono apoptozę w komórkach raka jelita grubego DLD-1 z użyciem cytometrii przepływowej. Leczenie mesalazyną spowodowało znaczącą redukcję żywotności komórek w porównaniu z komórkami kontrolnymi nieleczonymi (p < 0,001).

Analiza cytometryczna dodatkowo wykazała statystycznie istotny wzrost odsetka komórek apoptotycznych w grupie leczonej mesalazyną w stosunku do kontroli (p < 0,001), wskazując na indukcję programowanej śmierci komórki w odpowiedzi na ekspozycję na mesalazynę. W przeciwieństwie do tego zaobserwowano niewielki, ale statystycznie istotny wzrost komórek nekrotycznych w grupie kontrolnej nieleczonej w porównaniu z komórkami leczonymi mesalazyną (p < 0,05), co sugeruje, że mesalazyna preferencyjnie promuje apoptotyczną, a nie nekrotyczną śmierć komórki w komórkach DLD-1.

Brak istotnych zmian w odsetku komórek nekrotycznych wskazuje, że efekt mesalazyny nie był niespecyficzną cytotoksycznością, lecz wiązał się z kontrolowaną aktywacją szlaków apoptotycznych. Ten profil odpowiedzi komórkowej sugeruje selektywny efekt proapoptotyczny mesalazyny w badanym modelu komórkowym. „Nasze wyniki sugerują, że wczesne zastosowanie mesalazyny może znacząco poprawić kontrolę nad proliferacją nowotworową poprzez przywrócenie regulacji ujemnej szlaku MAPK” – piszą autorzy badania.

Jaki mechanizm molekularny wyjaśnia działanie mesalazyny?

Uzyskane wyniki są spójne z dobrze ustalonymi mechanizmami mesalazyny, która wywiera zarówno działanie przeciwzapalne, jak i przeciwnowotworowe głównie poprzez modulację wewnątrzkomórkowych szlaków sygnalizacyjnych. Mesalazyna hamuje ekspresję COX-2, tłumi sygnalizację β-kateniny i blokuje aktywację NF-κB, wpływając tym samym na sieci transkrypcyjne zaangażowane w zapalenie, homeostazę nabłonka i tumorigenezę.

W niniejszym badaniu wykazano, że mesalazyna dodatkowo działa jako silny induktor fosfataz o podwójnej swoistości (DUSP), kluczowych regulatorów ujemnych sygnalizacji MAPK. Szczególnie godną uwagi obserwacją jest zależna od typu komórki regulacja analizowanych fosfataz – mesalazyna zwiększała ekspresję DUSP4 i DUSP5 w nowotworowych komórkach DLD-1, jednocześnie redukując ich ekspresję w prawidłowych kolonocytach (CCD-841CoN).

Taka selektywna modulacja może przyczyniać się do korzystnego profilu terapeutycznego mesalazyny, ponieważ sugeruje, że lek preferencyjnie celuje w komórki złośliwe, oszczędzając prawidłowy nabłonek. To zachowanie zależne od kontekstu jest prawdopodobnie związane z różnicami w aktywności kinaz MAPK wyższego rzędu – szczególnie MEK1/2 i ERK1/2 – oraz fundamentalnymi różnicami w krajobrazach epigenetycznych i transkrypcyjnych komórek prawidłowych versus pochodzących z nowotworu.

Nadmierna aktywacja kaskady MAPK (ERK, JNK, p38) jest powszechnie uznawana za cechę charakterystyczną raka jelita grubego, napędzając proliferację, przeżycie i przewlekłe zapalenie. Fosfatazy DUSP funkcjonują jako kluczowe regulatory ujemnego sprzężenia zwrotnego tej sieci sygnalizacyjnej: DUSP1 defosforyluje ERK, JNK i p38, podczas gdy DUSP5 specyficznie celuje i inaktywuje jądrowy ERK1/2.

Silna indukcja DUSP5 zaobserwowana w tym badaniu – potwierdzona zarówno na poziomie mRNA, jak i białka – wskazuje, że mesalazyna może pomagać w przywróceniu tej istotnej kontroli sprzężenia zwrotnego w komórkach nowotworowych. Biorąc pod uwagę, że nadmierna fosforylacja ERK1/2 jest definiującą cechą tumorogenezy jelita grubego, zwiększenie ekspresji DUSP5 dostarcza wiarygodnego mechanistycznego wyjaśnienia działania przeciwproliferacyjnego i przeciwzapalnego leku.

Co to oznacza dla praktyki klinicznej i chemioprewencji?

Z perspektywy translacyjnej identyfikacja DUSP4 i DUSP5 jako genów reagujących na mesalazynę może mieć istotne znaczenie kliniczne. Te fosfatazy mogłyby służyć jako predykcyjne biomarkery odpowiedzi na mesalazynę, potencjalnie informując o strategiach chemoprewencyjnych u pacjentów z nieswoistymi zapaleniami jelit lub wczesnym stadium neoplazji jelita grubego.

Włączenie profilowania ekspresji DUSP do podejmowania decyzji terapeutycznych może również ułatwić rozwój podejść precyzyjnej onkologii, szczególnie dla osób z podwyższonym ryzykiem raka jelita grubego napędzanego zapaleniem. Ta selektywna modulacja może leżeć u podstaw bezpieczeństwa terapeutycznego mesalazyny poprzez ograniczenie jej aktywności przeciwproliferacyjnej do komórek złośliwych.

Niezależne dowody wskazują również, że DUSP5 funkcjonuje jako supresor nowotworowy, a jego obniżona ekspresja wiąże się ze złym rokowaniem w kilku nowotworach złośliwych. Ponowna ekspresja DUSP5 wykazała redukcję żywotności komórek nowotworowych i promowanie apoptozy, co jest spójne z podwyższoną ekspresją DUSP5 zaobserwowaną w komórkach DLD-1 leczonych mesalazyną.

Spośród ocenianych fosfataz DUSP5 może być szczególnie interesująca terapeutycznie ze względu na swoją wyłączną lokalizację jądrową i wysoką swoistość wobec ERK1/2. W przeciwieństwie do DUSP1, która działa na wiele MAPK i może być szybko degradowana, DUSP5 zapewnia bardziej stabilną i ukierunkowaną supresję jądrowej aktywności ERK. To czyni DUSP5 potencjalnie cennym biomarkerem i kandydatem regulatorem dla ukierunkowanych strategii chemoprewencyjnych.

Jakie są ograniczenia badania i kierunki dalszych analiz?

Pomimo cennych wniosków dostarczonych przez to badanie należy uznać kilka ograniczeń. Po pierwsze, badanie przeprowadzono in vitro z użyciem tylko dwóch linii komórkowych: prawidłowych komórek nabłonka okrężnicy (CCD-841CoN) i komórek raka jelita grubego (DLD-1). Chociaż te modele dostarczają ważnych informacji mechanistycznych, nie mogą w pełni odzwierciedlić złożoności i heterogeniczności guzów jelita grubego in vivo.

Ponadto, chociaż wykazano istotne zmiany w ekspresji genów i białka DUSP, nie przeprowadzono bezpośredniej oceny aktywności szlaku MAPK – takiej jak fosforylacja ERK1/2, p38 lub JNK – co stanowi istotne ograniczenie obecnego badania. Chociaż oceniono apoptozę metodą cytometrii przepływowej, dalsze analizy funkcjonalne dotyczące progresji cyklu komórkowego i zdolności proliferacyjnej wzmocniłyby mechanistyczny związek między modulacją DUSP, sygnalizacją MAPK i biologicznymi efektami mesalazyny.

Przyszłe badania powinny obejmować mechanistyczne analizy wykorzystujące technologie wyciszania genów, takie jak siRNA lub inżynieria genetyczna oparta na CRISPR, aby określić przyczynową rolę poszczególnych DUSP w mediowaniu efektów indukowanych przez mesalazynę na sygnalizację MAPK. Dodatkowo, aby bezpośrednio ocenić wpływ modulacji DUSP na kluczowe białka MAPK i ich formy fosforylowane, przyszłe badania powinny obejmować techniki proteomiczne, takie jak Western blotting lub podejścia oparte na spektrometrii mas.

Badania in vivo z użyciem modeli zwierzęcych lub organoidów pochodzących od pacjentów mogłyby zwalidować różnicową regulację genów DUSP w warunkach bardziej odpowiadających fizjologii. Podejścia multi-omiczne integrujące dane transkryptomiczne, proteomiczne i funkcjonalne mogłyby również ujawnić nowe biomarkery molekularne predykcyjne dla odpowiedzi terapeutycznej. Razem te badania rozszerzą nasze zrozumienie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw aktywności przeciwnowotworowej mesalazyny.

Czy mesalazyna może stać się narzędziem precyzyjnej chemioprewencji?

Niniejsze badanie wykazuje, że mesalazyna indukuje wyraźną, zależną od typu komórki przebudowę transkrypcyjną w komórkach nabłonka okrężnicy. Analizy transkryptomiczne i molekularne ujawniły, że mesalazyna znacząco zwiększa ekspresję DUSP4 i DUSP5 w komórkach raka jelita grubego (DLD-1), jednocześnie redukując ich ekspresję w prawidłowych kolonocytach (CCD-841CoN). Ta selektywna modulacja fosfataz o podwójnej swoistości sugeruje, że mesalazyna może działać jako regulator sygnalizacji MAPK zależny od kontekstu, preferencyjnie przywracając mechanizmy sprzężenia zwrotnego hamujące guz w komórkach złośliwych. Silna indukcja ekspresji DUSP5 – potwierdzona zarówno na poziomie mRNA, jak i białka oraz wsparta oceną apoptozy – wskazuje na kluczową rolę tej fosfatazy w mediowaniu efektów przeciwproliferacyjnych i proapoptotycznych mesalazyny w komórkach raka jelita grubego. Te odkrycia podkreślają DUSP4 i DUSP5 jako obiecujące molekularne markery odpowiedzi na mesalazynę i dostarczają mechanistycznego wglądu w jej potencjalną aktywność chemoprewencyjną w raku jelita grubego.