Repurposing leków w walce z gruźlicą: nowe nadzieje terapeutyczne

Czy gruźlica zmusza nas do nowych strategii terapeutycznych?

Gruźlica pozostaje jednym z najpoważniejszych zagrożeń zdrowotnych na świecie, odpowiadając za 1,25 miliona zgonów w 2023 roku i wyprzedzając COVID-19 jako najbardziej śmiertelny patogen zakaźny według najnowszego raportu WHO. W obliczu rosnącej oporności na leki przeciwgruźlicze, poszukiwanie nowych strategii terapeutycznych staje się priorytetem dla globalnej społeczności medycznej. Repurposing leków, czyli ponowne wykorzystanie już zatwierdzonych środków do nowych zastosowań, oferuje obiecujące podejście, pozwalające uniknąć długotrwałego procesu opracowywania nowych związków od podstaw. Warto zaznaczyć, że FDA dopiero niedawno zatwierdziła trzy nowe leki do leczenia gruźlicy: bedakilinę, delamanid i pretomanid, co podkreśla spadek w rozwoju nowych antybiotyków.

Naukowcy zidentyfikowali ThyX (Rv2754c), flawino-zależną syntazę tymidylanową, jako atrakcyjny cel terapeutyczny w leczeniu gruźlicy. Enzym ten pełni kluczową rolę w biosyntezie dTMP (2-deoksytymidyno-5-monofosforanu), niezbędnego składnika DNA, a co istotne – nie występuje u ludzi. W M.tb synteza de novo dTMP zależy od dwóch różnych syntaz tymidylanowych: ThyA i ThyX. W przeciwieństwie do ThyA, która wykorzystuje CH₃H₂-folian jako reduktor i źródło jednego atomu węgla, ThyX używa FAD i NADPH jako kofaktorów do produkcji zredukowanego tetrahydrofolianu (H₄-folian, THF) z metyleno-tetrahydrofolianu. ThyX jest niezbędny dla wzrostu Mycobacterium tuberculosis (M.tb) i wykazuje zwiększoną ekspresję w szczepach MDR-TB. Ponadto, ThyA jest enzymem pomocniczym, a mykobakterie polegają głównie na ThyX w syntezie tymidyny, co czyni go obiecującym celem terapeutycznym.

Czy nowe cele terapeutyczne otwierają perspektywy w repurposingu leków?

Badania skupiły się na dwóch zatwierdzonych przez FDA lekach: kwasie kargluminowym (CGA), stosowanym w leczeniu hiperamonemii, oraz mesalazynie (MSZ), wykorzystywanej w terapii chorób zapalnych jelit, jako potencjalnych inhibitorach ThyX. Leki te zostały zidentyfikowane jako potencjalne kandydaty do repurposingu w leczeniu gruźlicy przy użyciu badań przesiewowych in silico.

W przeprowadzonych badaniach zastosowano szereg technik spektroskopowych do analizy interakcji między ThyX a wybranymi lekami. Spektroskopia fluorescencyjna wykazała silne wygaszanie wewnętrznej fluorescencji (IF) białka w obecności obu związków, ze znaczącą zmianą długości fali emisji maksymalnej (przesunięcie 4-5 nm), wskazując na bezpośrednią interakcję z resztami tryptofanowymi. Analiza kinetyki wiązania potwierdziła statyczny mechanizm wygaszania (wartość stałej bimolekularnej kq > 10^12 M^-1s^-1), charakterystyczny dla formowania stabilnego kompleksu białko-ligand. Obliczona stała wiązania (Ka) rzędu 10^6 M^-1 dla obu leków wskazuje na silne powinowactwo do białka ThyX, przy stosunku wiązania zbliżonym do 1:1.

Dla potwierdzenia specyficzności obserwowanych interakcji przeprowadzono eksperymenty z kontrolami: kwasem para-aminosalicylowym (PAS) jako kontrolą pozytywną, który jest znanym inhibitorem enzymów szlaku folianowego, oraz diosminą jako kontrolą negatywną. PAS wykazał podobny profil wiązania do ThyX (Ka = 3,44 × 10^6 M^-1), podczas gdy diosmina nie wykazała znaczącej interakcji, co potwierdza wiarygodność zastosowanej metodologii. Badania z wykorzystaniem różnicowej kalorymetrii skaningowej wykazały, że PAS stabilizuje ThyX, potwierdzając jego powinowactwo wiązania.

Czy badania spektroskopowe odsłaniają zmiany konformacyjne ThyX?

Badania stabilności termicznej przy użyciu różnicowej fluorymetrii skaningowej (DSF) wykazały, że zarówno CGA, jak i MSZ powodują niewielkie zwiększenie temperatury topnienia (Tm) białka ThyX (o 1°C dla CGA i 0,5°C dla MSZ), co sugeruje stabilizujący wpływ tych związków na strukturę białka. Denaturacja chemiczna indukowana mocznikiem potwierdziła te obserwacje, wykazując zmiany w profilu rozfałdowania białka w obecności leków. Analiza z wykorzystaniem sondy ANS (anilino-8-naftaleno-sulfonian) dodatkowo wskazała na maskowanie hydrofobowych powierzchni ThyX przez badane związki.

Badania dichroizmu kołowego (CD) w dalekim nadfiolecie ujawniły, że interakcja z CGA i MSZ prowadzi do zwiększenia zawartości struktur α-helikalnych w białku ThyX (z 19,20% do odpowiednio 19,98% i 20,55%), wskazując na indukowanie bardziej zwartej konformacji. Te zmiany strukturalne mogą mieć istotny wpływ na aktywność enzymatyczną białka, potencjalnie hamując jego funkcję w biosyntezie dTMP.

Czy badania potwierdzają skuteczność działań przeciwgruźliczych in vitro?

Ocena aktywności przeciwbakteryjnej wykazała, że oba związki skutecznie hamują wzrost M.tb in vitro, z minimalnym stężeniem hamującym (MIC) wynoszącym 3,12 μg/ml dla CGA i 6,25 μg/ml dla MSZ. Badania kinetyki wzrostu potwierdziły znaczące spowolnienie namnażania bakterii w obecności obu leków. Co istotne, testy ex vivo na makrofagach RAW zakażonych M.tb wykazały znaczącą redukcję przeżywalności bakterii wewnątrzkomórkowych w obecności badanych związków, przy zachowaniu niskiej cytotoksyczności wobec komórek gospodarza. Badania przeżywalności komórek wykazały, że MSZ jest bezpieczny do stężenia 40 μg/ml, podczas gdy CGA wykazuje pewną cytotoksyczność przy 40 μg/ml, ale jest bezpieczny do 20 μg/ml.

W eksperymentach ex vivo zastosowano dwa stężenia każdego leku – równe MIC oraz dwukrotnie wyższe (2× MIC). Makrofagi RAW były infekowane szczepem H37RA przy MOI 1:10, a po 4 godzinach infekcji dodawano świeże medium zawierające odpowiednie stężenia leków. Analizę CFU (jednostek tworzących kolonie) przeprowadzono w różnych punktach czasowych (24, 48 i 72 godziny po infekcji), a kolonie liczono po 15 dniach. Wyniki wykazały znaczące zmniejszenie przeżywalności bakterii w obecności zarówno MSZ, jak i CGA przy obu badanych stężeniach.

Jak wyniki badań mogą wpłynąć na praktykę kliniczną?

Przedstawione wyniki mają istotne znaczenie kliniczne, sugerując możliwość zastosowania CGA i MSZ jako potencjalnych środków przeciwgruźliczych. Ich zdolność do wiązania się z ThyX i hamowania wzrostu M.tb, zarówno w warunkach in vitro, jak i ex vivo, przy jednoczesnym korzystnym profilu bezpieczeństwa, czyni je atrakcyjnymi kandydatami do dalszych badań. Strategia repurposingu leków może znacząco przyspieszyć proces wprowadzania nowych terapii przeciwgruźliczych, co jest szczególnie istotne w kontekście rosnącej lekooporności.

W szerszym kontekście, badania te wpisują się w trend wykorzystywania zaawansowanych technik molekularnych do identyfikacji nowych zastosowań istniejących leków. Podobne podejścia zostały zastosowane przez inne zespoły badawcze, które zidentyfikowały różne inhibitory ThyX, w tym związki takie jak plumbagina (wyekstrahowana z rośliny Plumbagin indica), 2-chloro-3-(4-metanosulfonylopiperazyn-1-yl)-1,4-dihydronaftalen-1,4-dion, idebenon czy pochodne 5-(3-oktanamidoprop-1yn-1yl)-2′-deoksyurydyno-5′-monofosforanu. Przedstawione badania uzupełniają tę rosnącą bazę wiedzy, oferując nowe możliwości terapeutyczne w walce z gruźlicą.

Dla lekarzy klinicystów, szczególnie specjalistów chorób zakaźnych i pulmonologów, wyniki te otwierają perspektywę potencjalnego wykorzystania CGA i MSZ w terapii gruźlicy, zwłaszcza w przypadkach oporności na standardowe schematy leczenia. Niemniej jednak, przed wprowadzeniem tych leków do praktyki klinicznej w nowym wskazaniu, konieczne są dalsze badania, w tym badania in vivo oraz próby kliniczne, aby w pełni ocenić ich skuteczność i bezpieczeństwo w kontekście leczenia gruźlicy.

Podsumowanie

Gruźlica, odpowiedzialna za 1,25 miliona zgonów w 2023 roku, pozostaje najgroźniejszym patogenem zakaźnym na świecie, przewyższając śmiertelność COVID-19. W obliczu rosnącej oporności bakterii Mycobacterium tuberculosis na dostępne leki przeciwgruźlicze oraz ograniczonej liczby nowych antybiotyków, naukowcy poszukują alternatywnych strategii terapeutycznych. Jednym z obiecujących podejść jest repurposing leków, czyli ponowne wykorzystanie zatwierdzonych już środków farmaceutycznych do nowych wskazań. Kluczowym celem terapeutycznym stał się enzym ThyX, flawino-zależna syntaza tymidylanowa niezbędna do biosyntezy DNA u prątków gruźlicy, której nie posiadają komórki ludzkie. Badania zidentyfikowały dwa zatwierdzone przez FDA leki – kwas kargluminowy, stosowany w leczeniu hiperamonemii, oraz mesalazynę, używaną w terapii chorób zapalnych jelit – jako potencjalne inhibitory ThyX. Zaawansowane techniki spektroskopowe potwierdziły silne wiązanie tych związków z białkiem docelowym, ze stałą wiązania rzędu 10^6 M^-1, oraz wykazały zmiany konformacyjne prowadzące do stabilizacji struktury enzymu. Badania in vitro wykazały skuteczne hamowanie wzrostu Mycobacterium tuberculosis przy minimalnym stężeniu hamującym wynoszącym 3,12 μg/ml dla kwasu kargluminowego i 6,25 μg/ml dla mesalazyny. Testy ex vivo na zakażonych makrofagach potwierdziły znaczącą redukcję przeżywalności bakterii wewnątrzkomórkowych przy zachowaniu niskiej cytotoksyczności wobec komórek gospodarza. Te odkrycia otwierają nową perspektywę terapeutyczną w walce z gruźlicą, szczególnie w przypadkach lekooporności, choć przed wprowadzeniem do praktyki klinicznej konieczne są dalsze badania in vivo oraz próby kliniczne oceniające skuteczność i bezpieczeństwo tych leków w nowym wskazaniu.